第七节 光镜免疫金银细胞化学方法
一、免疫金染色
（一）免疫金法（IGS）
1987年，Geoghegan等首次应用免疫金探针检测B淋巴细胞表面抗原，建立了用于光镜水平的免疫金法（Immunogold staining, IGS）。IGS的特点是染色程序简便，不要显色，就能检测细胞表面的抗原，又能检测细胞内抗原。染色时免疫金法一般要求金颗粒的直径大于20nm，并且用的浓度较高。用IGS定位细胞抗原时一般都采用间接法，下面以人肝组织HBsAg的定位为例说明IGS的步骤：
（1）石蜡切片→脱蜡至水。
（2）0.1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3）用双蒸水振洗5＇×2。
（4）用0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（5）1%卵蛋白（EA）封闭10min。
（6）稀释鼠抗HBsAg单克隆抗体（用0.02mol/l TBS pH8.2 作1：100稀释），4℃过夜。
（7）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（8）1%EA封闭10min。
（9）0.02mol/l TBS pH8.2 稀释兔抗鼠金标抗体（1：8）37℃45min。
（10）0.02mol/l TBS pH8.2振洗10＇×2。
（11）双蒸水振洗5＇×2。
（12）1%戊二醛，10min。
（13）双蒸水5min 。
（14）用苏木素衬染核1min，甘油封片。
结果：在光镜下可见部分肝细胞浆内有金颗粒聚集呈红色，沿细胞膜分布，表明有HBsAg定位在细胞浆内。
（二）蛋白A-金（PAG）放大法
为了得到更明确的染色结果，在用IGS方法定位细胞抗原时可采用搭桥法，使IGS得到放大，这里介绍一种用抗A蛋白抗体作桥的PAG放大法。下面以5-羟色胺定位为例说明这一新方法。
（1）石蜡切片→脱蜡至水。
（2）1%胰蛋白酶消化10min或3mon/L尿素消化30min。
（3）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（4）1%EA封闭组织10min。
（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释兔抗5-羟色胺抗体（1：1000）4℃过夜，或者37℃1h。
（6）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5＇×2。
（7）1%EA封闭10min。
（8）用0.05mol/l pH7.4 TBS 稀释PAG（1：40），37℃1h。
（9）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（10）1%EA封闭10min。
（11）抗A蛋白抗体（1：100）37℃。45min。
（12）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（13）加0.05mol/l pH7.4 TBS稀释PAG（1：40），37℃45min。
（14）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗10＇×2。
（15）双蒸水振洗5min。
（16）1%戊二醛10min。
（17）双蒸水振洗5min。
（18）0.01%伊文思蓝2min，甘油封片。
光镜下观察，小肠粘膜内含有嗜银颗粒的细胞胞浆呈红色，阳性颗粒位于细胞核底部，比单纯用PAG染色深度得到加深，阳性结果得到放大。由于抗A蛋白抗体既能通过Fab段又能够通过Fc段与PAG上的A蛋白结合，因此，与其它桥抗体相比它能够在抗原位点处聚集更多的胶体金颗粒。基本原理如下图5-3。
图5-3 PAG放大法原理
PAG放大法的优点：①使用试剂单一；②可大大提高IGS的敏感性，从而使应用IGS方法定位抗原时使用高稀释度的抗体成为可能；③背景干净。可以预见这一新方法将很快受到人们的关注。
二、免疫金银法
1983年，Holgate等人将IGS与银显影方法相结合创立了免疫金银法（Immunogold—sliver staining, IGSS）IGSS的基本原理是通过免疫反应沉积在抗原位置的胶体金颗粒起着一种催化剂作用，用对苯二酚还原剂将银离子（Ag+）还原成银原子（Ago）。被还原的银原子于是围绕金颗粒形成一个“银壳”，“银壳”一旦形成本身亦具有催化作用，从而使更多银离子还原并促使“银壳”越长越大“，最终抗原位置得到清楚放大。请参见图5-4。
图5-4 用银增敏示意图
（一）石蜡切片的IGSS染色
以人肝细胞内HBsAg定位举例说明。
（1）切片常规脱蜡至水。
（2）Lugol＇s液，5min.
（3）5%硫代硫酸钠水溶液脱碘5min。
（4）用双蒸馏水冲洗干净。
（5）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（6）用0.1%胰蛋白酶消化10min或用3mol/L尿素消化20min。
（7）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min一次。
（8）1%卵白蛋白封闭15min。
（9）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37℃1～2h 或4℃过夜。
（10）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（11）1%卵白蛋白封闭10min。
（12）1：40，PAG，37℃45min。
（13）0.05mol/l pH7.4 TBS洗5min两次。
（14）双蒸水洗5min，两次。
（15）物理显影见后所述。
（16）双蒸水洗5min，两次。
（17）苏木素衬染。
（18）酒精常规脱水，透明，封固。
结果，光镜下见肝细胞胞浆内有膜或包涵体形分布的阳性黑色状颗粒，背景干净。
（二）冰冻切片的IGSS染色
作冰冻切片的组织，若在动物试验可以先经过固定液灌注或浸泡固定，也可不固定先做冰冻切片。人的组织也可通过浸泡固定或不固定，这主要根据保存抗原性的需要而定。固定过的组织可用20%蔗糖PBS（0.01mol/l pH7.2）浸泡2～4h或在切片时用OCT包埋，以减少冰冻切片过程中冰晶的形成。如果切片还准备用于电镜包埋，则可经过5%，10%，20%浓度逐级递增的蔗糖溶液。在冰冻切片前，可先入氟里昂–22 （Freon--22）骤冷，这样可使组织的结构保存更好，适用于电镜观察。
（1）冰冻切片。
（2）Lugol＇s液，5min.
以下步骤同人肝HBsAg的染色方法。
（三）半薄切片的IGSS染色
IGSS染色的半薄切片，可以在光镜下直接观察阳性结果，为电镱取阳性部位及观察打下良好的基础。环氧树脂会妨碍免疫组化染色。经过饿酸处理后固定的组织同样也会影响抗原抗体反应，因此，半薄切片作IGSS染色剂，应作以下处理。
（1）脱环氧树脂，切片以NaOH的无水乙醇饱和溶液浸泡30～60min，然后以无水乙醇洗5min，两次，再以95%，80%，70%酒精各洗5min，然后入水。
（2）经饿酸固定过的切片入1%过碘酸10min（0.5μm厚，时间可随切片厚薄增减）除去饿酸，然后蒸馏水洗5min，4次。
（3）切片用0.05mol/l TBS,pH7.4洗10min。
（4）按石蜡切片第二步往下进行。
三、彩色免疫金银法（CIGSS）
彩色免疫金银法（coloured IGSS简称CIGSS）是在IGSS基础上发展起来的一种新方法。其基本原理与彩色显影相似。IGSS方法染色在抗原位点处生成银颗粒经铁氰化钾与溴化钾的作用即被氧化成溴化银，后者与彩色显影剂相接触立即被还原成金属银，而彩色显影剂本身则被氧化，其氧化产物使彩色成色剂由无色变成有色的染料并沉积在银颗粒的部位，金属银变成了银离子。由于染料只能通过彩色显影剂沉积在有银的部位，所以不与组织发生非特异性吸附。
以彩色显影人肝组织内HBsAg的操作过程为例：
（1）脱蜡至水。
（2）0.1%胰蛋白酶37℃10min。
（3）Lugol＇s,碘液5min。
（4）5%硫代硫酸钠1min。
（5）用0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（6）1%卵白蛋白封闭10min。
（7）马抗HBsAg抗体1：1000稀释，37℃1～2h 或4℃过夜。
（8）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（9）1%卵白蛋白封闭10min。
（10）PAg 1：40，37℃45min。
（11）0.05mol/l pH7.4 TBS振洗5min，两次。
（12）双蒸水洗5min，两次。
（13）物理显影（见P116页物理显影配方）。
（14）自来水冲洗。
（15）双蒸水洗5min，两次。
（16）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。
（17）双蒸水冲洗。
（18）彩色显影（α-萘酚或菲尼酮）2min。
（19）双蒸水冲洗。
（20）2%铁氰化钾和1%溴化钾，1min。
（21）2%铁硫代酸钠和1%亚硫酸钠，5min。
（22）流水冲洗。
（23）如需要可用苏木素或核红复染。
（24）缓冲甘油封固，观察。
结果：CIGSS的优点：①阳性结果比黑色更鲜明;②可以使弱信号得到放大;③消除IGSS背景染色;④信号/背景比值高;⑤是开展免疫金银双标技术的新途径.光镜下见HBsAg阳性物质呈鲜艳的蓝色(α-萘酚为成色剂)或呈绿色(菲尼酮为成色剂)。背景干净，阳性结果清楚。
四、免疫金及免疫金银技术的优点
免疫金银技术（Immunogold—sliver Technique）是在免疫金基础上发展的新兴的先进的免疫细胞化学检测技术，它比免疫荧光，免疫酶标技术有许多独特的优点。
1．制备方法简单，易行。
2．标记简单抗体、凝集素、酶、SPA、激素等很容易通过物理吸附作用与胶体金颗粒相结合形成稳定的金标复合物。由于在标记过程中不需要经过任何化学方法交联，抗体的生物活性可保持不变，标记方法简单容易。
3．适用范围广 胶体金银技术既能用于光镜也能用于透射及扫描电镜，同时还可用于X线能谱分析。在荧光显微镜上添置一块特制的滤板（IGs filter block）还可直接对胶体金颗粒进行观察，金颗粒在荧光显微镜下呈现明亮的点状物，定位准确，敏感性高，标本可长期保存。
4．特异性强免疫金探针的非特异性吸附作用小，较少受生物组织背景因素的影响，在抗原或抗体的检测中显示出高度的特异性。
5．敏感性高由于金颗粒的电子密度很大特别适合透射电镜及扫描电镜，因此，免疫金银法用于电镜，其检测抗原或抗体率远远超过酶反应物，从而大大改进了免疫细胞化学技术在电镜水平上的分辨率。光镜下金颗粒经过银显影后得到放大，用于检测组织细胞抗原时其敏感性比PAP法高200倍。我们检测肝炎表面抗原时比ABC法高6倍，是至今为止最为敏感的免疫细胞化学方法，特别适合于检测微量抗原及石蜡切片标本中的微弱抗原。
应用彩色IGSS和IGSS双标及多标记，可在同一张切片上检测两种以上的抗原成份。胶体金可以制备成不同大小的颗粒，将不同直径的胶体金分别标记不同的抗体或抗原，可以在同一张标本上同时区分出两种或两种以上的抗原或抗体，非常适用于电镜水平的双标和多标记，为研究细胞内抗原及多种抗原的表达及各种抗原分子相互之间的关系等提供了最佳手段。
免疫金银技术是新兴的科学技术，目前许多实验室越来越广泛地采用这一新技术，从而使它的发展有了扎实的基础。用免疫荧光、免疫酶技术、放射免疫技术可做的工作，均可使用免疫金银技术。另外，这一新的方法在其它技术的配合下不断地得到更新与进步，使它能经常增添新的内容，特别是免疫金和胶体金示踪作为一门独特的新技术将在生物医学及其它领域的研究中发挥着越来越大的作用。
五、在IGSS染色中常见技术问题和对策
（一）背景染色产生的原因和防止方法
（1）第一抗体或金标抗体稀释度不合适，一般容易犯抗体使用过浓的毛病，认为抗体越浓越好，结果适得其反。应该先作方阵滴定，优选最佳稀释倍数（见第一章 ），即可避免非特异性染色，又可节 省抗体。
（2）使用正常箅清封闭和在抗体稀释液中加入牛血清白蛋白，可以减少非特异吸附，降低背景染色。
（3）显色的器皿必须彻底清洗，化学试剂必需用三蒸馏水配制。
（4）乳酸银和硝酸银的显色在避光的环境中反应。醋酸银则可在有光的环境中显色。
（5）显色时切片应垂直放置在银显影液中，使过多的银颗粒下沉，如水平放置易沉淀于切片上。
（6）控制反应时间，显影液加入适量的阿拉伯胶或明胶可以延缓反应速度，避免形成过多的还原银，非特异地吸附在切片上。一般加入明胶1%～2%，效果比较满意，反应时间根据室温而定，室温25℃左右显色时间10～15min，室温在20℃以下，显色时间20～30min左右。
（7）洗涤：使用TBS时最好加入0.05%～0.1%的Triton X-100或Tween 80，可以洗脱掉组织表面发生非特异性吸附的污染蛋白，防止出现背景的非特异染色。
（二）背景染色已发生应如何消除
（1）2%硫代硫酸钠，1%铁氰化钾等量混合，加在切片上至背景无色为止。
（2）2%铁氰化钾和1%溴化钾等量混合作用1min水冲洗，然后加上2%硫代硫酸钠和1%亚硫酸钠脱色，至背景干净为止。
（3）0.1%重铬酸钾加0.25%浓硫酸，在显微镜下控制脱色时间，至阳性结果清楚，无背景为止。然后用5%硫代硫酸钠漂白。注意时间不要过长，以免阳性结果被脱掉。
（4）用0.3%～1%的H2O2处理切片也可消除背景的银颗粒。但必须在显微镜下控制脱水时间，防止把阳性结果脱色。
（三）彩色显影背景过染的处理方法
彩色免疫金银法，在胶体金技术中是一个很大的突破，它的优点是结果鲜明，对比度好，但是在彩色显影过程中时间过长，背景可有一些着色，彩色显影的时间控制很重要。一旦过染可用以下方法处理。
（1）纯酒精滴到切片上3～5s,立即冲掉，水洗，充分地把酒精洗掉，如果洗不彻底，造成阳性结果脱色。
（2）75%的酒精滴到切片上1min，立即冲掉，脱色不能时间过长，过长后阳性结果全部脱掉。
六、物理显影液及缓冲液的配制
（一）缓冲液的配制
（1）0.05mol/l pH7.4 TBS 配制
Tris（三羟甲基胺基甲烷）12.1g
NaCl 17.5g
加双蒸水1900ml
然后用浓HCL调至pH为7.4再加双蒸水至2000ml
Tris 4.84g
NaCl 17.5g
BSA 2.0g
NaN31.0g
双蒸水1900ml,充分搅拌至溶质完全溶解,用浓HCl调pH至8.2,再加双蒸水至2000ml。
（二）银显影液的配制
1．乳酸银显影液的配制：混合以下溶液
①10%阿拉伯胶水溶液60ml
②枸橼酸缓冲液pH 3.5 10ml
③对苯二酚1g,加双蒸水20ml溶解。
④乳酸银水溶液100 mg加水10ml。
注意在暗处显影。
2．硝酸银显影液的配制
①10%阿拉伯胶水溶液60ml。枸橼酸缓冲液ph 3.5 10ml
②对苯二酸1.7g水溶液30ml。
③硝酸银40mg水溶液2ml。
①②两溶液完全溶解，临用前加入硝酸银溶液。在暗处显影。
4．彩色显影液的配制
①0.2N氢氧化钠的异丙醇溶液5ml溶入100mgα-萘酚（或菲尼酮）。
②500mg碳酸钠，25mg溴化钾，50mg亚硫酸钠，加双蒸水25ml。
①②两液1：10混合，室温下彩色显影。
5．醋酸银显影液
①15%阿拉伯胶60ml，柠檬酸缓冲液10ml，pH3.5。
②对苯二酚1.7g溶于20ml蒸馏水中。
③醋酸银100mg溶于蒸馏水10ml中。
用前①②③依次混合，不需要避光，在室温下显影。
（三）柠檬酸缓冲液的配制
柠檬酸（C6H8O7.H2O）25.5g
柠檬酸三钠（Na3C6H5O7.2H2O）23.5g
加重蒸水100ml溶解即成，pH3.5
(四)氢氧化钠（NaOH）无水乙醇饱和溶液的配制
8g氢氧化钠，加入100ml无水乙醇振摇溶解即成。