有效实验性动物模型的建立和应用是中医证候基础研究的基石。90年代就有学者在开展肝郁证模型的研究时提出两大即便是到现在仍有很大参考价值的可能导致肝郁模型定性不准的症结问题:一是对“肝郁”的定义, 认为“肝郁”是一类证, 是对几个近似证候的概称, 不是单一证, 而复制类证模型容易出现的问题就是引起应用与判断上的混乱。二是实验动物的情志表现, 行为如何定性与评判的问题, 缺乏统一的认知与标准[1]。这些年来, 致力于中医实验动物模型的研究不断深入, 有些实践逐渐完善成熟成为共识, 有些则逐渐被淘汰, 这些经验对后来者的研究都有很高的借鉴意义。
常见肝郁证模型
目前, 比较公认的肝郁造模是借鉴慢性束缚法或者不可预知的慢性应激方法, 近年来在肝郁类证基础上分型造模的研究逐渐增多, 使得肝郁模型在判断及应用上更为明晰, 而这类模型也多是在不可预知的慢性应激方法基础上结合具体证型的关键特征发展而成的复合模型。
1. 肝郁气滞模型
慢性轻度不可预见性应激和慢性束缚是常见的造肝郁模型的方法, 前者通过将几种不同的应激因子随机运用, 后者是将实验动物置于束缚器具内限制其活动, 使实验动物发生情志改变。
2.肝郁化火动物模型
肝郁模型以及肝郁气滞模型的设置多是参考经典抑郁模型, 基于此, 赵振武等[2]提出参考经典高架十字迷宫实验, 建立焦虑应激模型, 以不确定性空瓶饮水刺激作为情绪应激源, 建立肝郁化火模型。
3.肝郁脾虚模型
肝郁脾虚模型是近年来研究较多的复合模型, 采用比较多的方式是束缚器慢性束缚, 配合强迫游泳使其过度疲劳以及隔日喂食使其饮食失节[3,4]。基于脾虚证涉及到的疾病范围广泛, 造模可能不够精准, 很多学者尝试用更加有针对性的方式建造疾病模型。例如, 黄娜娜等[5]用不同乙醇浓度灌胃+饮食失节建立肝郁脾虚证急性肝损伤病证结合模型。
此外, 赵迎盼等[6]尝试用“病+证+症”三因素组合造模, 除了选用经典的早期母婴分离复制肠易激综合征疾病模型, 同时选用慢性束缚法造成肝郁脾虚的证候模型, 加上用番泻叶灌胃的方法造成大鼠表现以腹泻为主要症状, 以此综合造成肝郁脾虚模型肠易激综合征腹泻大鼠模型, 无独有偶, 涂星等[7]同样采用早期母婴分离的方式再结合冰水灌胃法和限水法造成肝郁脾虚型肠易激综合征便秘大鼠模型。
4.其他肝郁证复合模型
其他模型也多是在肝郁模型基础上根据实际情况发展而成的复合模型, 如, 周兴等[8]采用孤养40周龄种鼠, 给予复合情志刺激的方法建立肾虚肝郁证动物模型。张建军等[9]用慢性束缚配合辐照的方法建立肝郁血虚模型。
常见肝郁证模型方法的评价
常见的肝郁模型方法的评价除了一般体征情况, 主要包括行为学改变、理化指标改变以及方药反证。
1. 行为学改变
肝郁证模型中常选用精神行为学指标评价模型动物主要行为学的改变。包括反映抑郁绝望状态的悬尾试验和强迫游泳实验, 以及综合反映实验动物的抑郁焦灼情绪和环境适应能力的旷场实验, 其中尤以旷场实验最为多用。
1.1 旷场实验
旷场实验观察指标主要包括水平穿越格数、直立攀壁次数、总的运动距离 (反映动物的探究行为和活动度) 、中央格停留时间和修饰时间 (反映动物的认知能力和警觉性) 。一般肝郁造模后实验动物水平穿越格数、直立次数以及运动距离缩短, 中央停留时间和修饰时间增加, 表现出探究行为减少, 认知能力降低, 警觉性降低, 伴随一定的抑郁情绪。也有研究发现造模期间实验动物出现一过性的探究行为增加, 即出现一定的焦虑情绪[10], 赵荣华等[4]在对比肝郁、脾虚和肝郁脾虚模型旷场实验行为学时发现肝郁证早期存在一定的焦虑情绪, 脾虚证还呈现易激惹状态, 而肝郁脾虚模型早期还是以抑郁状态为主。
1.2 悬尾实验和强迫游泳实验
悬尾试验通过计算动物间断性出现的“不动”时间, 以此来显示动物的失望状态, 多数实验显示, 造模后动物出现的不动时间延长, 一定程度反映动物的抑郁趋势[11]。
大鼠强迫游泳测量指标记录实验动物不动时间和上窜时间多见。不动时间主要以大鼠浮在水面的微小动作为准, 上窜时间的判定主要是大鼠做四肢挣扎的动作[12]。多数实验显示, 造模后动物的不动时间延长。
2. 理化指征改变
肝郁证模型评价指标的选择多是目前比较公认的能部分反映肝郁证机制的理化指征, 尤以神经-内分泌系统单胺类神经递质多见。随着肝郁证复合模型的深入研究, 相关的理化指征检测已不再局限于情志因素本身, 例如在反映肝郁脾虚功能时也有将消化系统D-木糖排泄率、胃排空率和肠道推进率作为评价模型的参考指标[13]。也有学者通过代谢组学的方法筛选出醋酸、乳酸、酪氨酸等5种代谢物可作为肝郁脾虚证的生物标志物[14]。
3. 药物反证及其他方法
药物反证肝郁证模型的思路是“以方测证”的延续, 目前仍是以经典方药为主。此外, 也有采用动物外观行为积分量表作为辅助模型成功的标准[12], 或者是改进动物模型量表, 通过采集同一批实验动物不同时段指标间相关性、差异度和指标结构效度来检验预先设定的造模理论能否成立[15]。
讨论
通过梳理这些年有关肝郁证模型及其评价方法的研究进展, 可以发现, 造模方式的选择更加贴近临床, 一些药物注射法, 如CCl4急性中毒法这类会造成实验动物肝脏损害的方法逐渐被更符合肝郁证发病机制的方式取代。其次, 就90年代提出来的有关肝郁证造模的两大难点, 也取得一定的成果。比如, 从类证的范围对肝郁证的理解得到更多研究者的认可, 近年来肝郁证之下的分型小证的研究逐渐增多, 肝郁证复合模型成为大的研究趋势, 这从一定程度上解决了部分由于肝郁证范围太广而出现应用较为混乱的问题。其次, 有关实验动物的行为如何定性情志的问题, 也逐渐有较为统一的认知与标准。
虽然有很多学者已经在探索筛选更科学的动物模型检测指标, 如, 杨宗纯等[16]提出的通过对比证候模型与人群特征指标普提炼方证相关关键指标群为进一步研究提供思路, 但某些客观指标的改变对肝郁证机制研究中的影响程度, 是否足够代表肝郁证的本质, 甚至于达到可以诊断肝郁证的标准, 仍是一大难题。其次有关肝郁证与抑郁症之间的关系, 如何有效的借鉴和改进抑郁症的造模方法和评价方法也样值得深究[17]。其次有关肝郁证与抑郁症之间的关系, 如何有效地借鉴和改进抑郁症的造模方法和评价方法也同样值得深究[17]。
针对现存肝郁造模的主要问题, 肝郁证有别于抑郁症, 肝郁证标准的建立终归要立足于中医肝郁证理论及临床的深刻认识, 老一辈科研工作者一针见血提出的“证理论、临床研究应优于证模型研究, 模型动物生物学特性研究应先于证模型复制研究”乃至今日也有很大的指导价值。
来源：中华中医药杂志 作者：胡柳 卓泽伟 阮璐薇 张鹏橫 李灿东 梁文娜