论蛋白质组学与中医证候研究
随着全球基因组计划的完成， 人类对生命科学 研究开始进入了以基因组学、 蛋白质组学、 营养组 学、 代谢组学等 “组学” 为研究标志的后基因组学时 代。 蛋白质组学是在蛋白质水平上重新认识生命机 理的学科， 其学术观念与相关技术已经被广泛应用 于生命科学研究的各个领域， 并已成为人类重大疾 病诊断、 治疗的有效方法。 蛋白质组学以其整体性、 复杂性、 动态性、 阶段性、 稳定性的特点与中医证候 的整体观、 恒动观、 辨证论治思维模式不谋而合， 因 此在揭示中医疾病的证候本质方面具有巨大优势。
中医证候与蛋白质组学
“证” 是疾病发生和演变过程中某一阶段本质 的反映， 它以一组相关的症状和体征为依据， 不同程 度的揭示当前的病因、 病性、 病位、 病势等 [1] 。 “证” 是对致病因素与机体反应两方面情况的综合， 是对 疾病当前本质所做的结论。 辨证论治与整体思想是 中医学的核心思想。 但是由于中医证候体系的复杂性 使得其难以用还原论指导下的现代医学方法来揭示 其科学内涵， 虽然现阶段对中医证候的本质进行了 大量的研究工作， 但是距离真正揭示中医证候本质的全貌还有相当一段距离。 传统中医认为， 证的形成 主要与个体体质的差异有关， 是随着病程发展、 病 情演变而不断变化着的， 是疾病的本质在人体的阶 段反映 [2] ， 但中医药的 “辨证施治” “同病异治” “异 病同治” 等观念却与 “蛋白质组学” 的许多理念不谋 而合。 所以， 应用蛋白质组学研究中医证候的技术因 此应运而生。 然而传统中医诊法主要是通过医生的 “望闻问切” ， 并结合自身经验辨析来判断病证， 其 诊断结果往往缺乏客观评价标准， 缺乏对各类信息的 客观记录， 极大地影响诊断的可信度和可重复性 [3] 。 因此， 将蛋白质组学技术引入中医证候本质的研究 虽然面临诸多问题， 但是同样也为中医证候的进一 步发展带来新机遇。
蛋白质组学是基因组学的进一步发展
2001年人类基因组计划的科学家宣布人类基因 组图谱基本绘制完成， 标志着人类对生命科学的探 索进入了一个崭新的领域。 同时也标志着 “后基因时 代” 的到来。 功能基因组学成为研究的核心内容， 蛋 白质组学又是功能基因组学的重点。 蛋白质是基因 功能的载体与执行者， 因此， 基因组或者mRNA的研 究不能代替蛋白质组学的研究， 蛋白质组学的研究 是对前者的继承与发展。 通过大量的文献发现， 蛋 白质组的组成远比基因组庞大和复杂， 一个基因可 以产出多个蛋白质， 据估计， E.cOIi 1个基因可编码 1.3个蛋白； S.cerevisiae 1个基因可编码3个蛋白； 人的 1个基因大约可编码10种蛋白 [4] 。 因此， 基因组具有统 一性， 蛋白质组具有多样性； 基因组数量有限， 蛋白 质组数量相对无限； 基因组是静态的， 蛋白质组是动 态的。
蛋白质组学应用于中医证候研究
近年来， 国内外学者把蛋白质组学技术应用于中 医证候的研究并取得了显著的成就， 现在的研究领域 主要集中在动物实验与临床研究两个方面， 其研究成 果有利于从新的角度加深对中医证候的认识。 下面将 分别从动物实验与临床研究展开相应论述。
1. 动物实验研究 马增春等在四物汤对血虚证 的研究中应用辐射和放射线模拟出血虚证的动物模 型。 用二向电泳、 图象分析、 质谱鉴定等蛋白质组学 技术测定四物汤对血虚证小鼠血清中有关影响的蛋 白， 结果发现， 四物汤可使血虚证小鼠血清中12个下 调和4个上调的蛋白质有所恢复， 进一步通过质谱鉴 定技术发现其中4个蛋白质可能是DNA依赖蛋白激 酶（DNA-dependent protein kinase catalytic sub-unit， P97313） 、 肌细胞增强蛋白 （dystrophin， P11531） 、 马达蛋白 （KIF13A， Q9EQW7） 、 肌动蛋白结合蛋白 （dys-tonin， Q9QX20） ， 从而得出结论： 四物汤可能 通过对血虚证小鼠血清中蛋白的影响而促进骨髓造 血、 减轻辐射引起的机体损伤 [5-6] 。 卢德赵等 [7] 在温补药对肾阳虚的研究中给大鼠 注射丙基硫氧嘧啶模拟肾阳虚的动物模型， 同时给 予温补肾阳药治疗大鼠， 把肝线粒体蛋白质经荧光 染料Cy2、 Cy3、 Cy5标记， 等量混合后在同一胶中进 行电泳分离， 经不同光激发后扫描得到不同样品的 蛋白质组图谱。 经DeCyder软件进行差异蛋白质组分 析， 筛选出16个差异蛋白质。 经质谱测定及数据库对 比， 其中10个蛋白质得到鉴定。 随后给予温补肾阳药 治疗后， 上述蛋白质的表达量均有不同程度的改善。 另有学者通过多次大量注射氢化可的松模拟肾阳虚 小鼠， 用双向电泳技术对正常小鼠和肾阳虚小鼠肾脏 蛋白进行分离， 并通过专业软件对正常小鼠、 肾阳虚 小鼠及经补阳中药治疗小鼠的肾脏蛋白质组学差异 进行比较， 筛选出了大量具有阳性指标的差异蛋白 质， 该研究将进一步分析这些差异蛋白质的性质和 种类， 并建立肾阳虚蛋白质数据库， 为以后深入研究 奠定基础 [8] 。
在肝阳上亢导致偏头痛的研究中， 有多位学者 通过不同的造模方法制造模型大鼠， 并对模型大 鼠、 健康组大鼠及治疗组大鼠的脾脏淋巴细胞肾上 腺及下丘脑等处蛋白质点的表达和种类进行分析 归纳， 发现多组对肝阳上亢所致偏头痛的形成、 治 疗可能有关的蛋白质， 这对进一步了解偏头痛的发 病机制和进行更有针对性的治疗提供了依据 [9-12] 。 张娴等 [13] 模拟高血压病肝阳上亢证大鼠模型， 探讨 高血压病肝阳上亢证候相关蛋白表达情况。 他采用 自发性高血压大鼠（SHR） ， 灌服附子汤6周后应用 双向电泳技术分析大鼠的肝脏蛋白质组变化。 结果 发现， SHR组和肝阳上亢组的蛋白斑点总体分布相 似， SHR组共检测到蛋白质点数为（716±58）个； 肝 阳上亢组 （875±19）个， 仅在肝阳上亢组表达的蛋白 质有27个； 有28个点在表达量上有明显变化（5倍以 上） ， 其中15个点下调， 13个点上调。 近年来， 张扬 等 [14] 建立高血压病肝阳上亢证与出血性中风、 缺血 性中风肝阳化风证脾淋巴细胞双向凝胶电泳图谱， 并识别鉴定肝阳上亢证与肝阳化风证相同与差异表达的蛋白， 通过双向凝胶电泳， 蛋白质组双向电泳图 像 （PDQUEST）软件分析， 目标蛋白质点用基质辅助 激光解析电离质谱进行鉴定发现， 肌动蛋白β等4个 蛋白在3组模型组中均较正常组表达上调， 肝阳化风 组较肝阳上亢组表达上调； 膜联蛋白Ⅲ等3个蛋白在 3组模型组中均较正常组表达下调， 肝阳化风组较肝 阳上亢组表达下调； 膜联蛋白Ⅲ等7个蛋白在出血性 中风组与缺血性中风组比较表达无明显差异。 对进 一步分析不同证型的蛋白表达有着积极的意义。 杨 波等 [15] 对高血压病脑出血急性期肝阳化风证患者外 周血单个核细胞进行了差异蛋白检测， 鉴定出肌动 蛋白等3种差异蛋白， 这些蛋白与细胞骨架、 凝血及 炎性反应相关。
另外蛋白质组学的动物模型还涉及到脾阳虚、 脾阴虚 [16] 、 气虚血瘀 [17-18] 、 热毒血瘀 [19] 、 肝郁 [20-21] 等。 中医证候的动物实验研究是基础与临床之间的桥 梁， 相信随着蛋白质组学技术的进一步发展， 关于中 医证候动物模型将有更进一步的研究与发现。 2. 临床实验研究 目前蛋白质组学的临床研究 主要集中在高血压病、 肿瘤、 冠心病等人类常见的疾 病当中。 下面分别通过中医临床常见病证分型 “异病 同证” 和 “同病异证” 展开相应论述。 2.1 异病同证 对中医肝阳上亢证的研究中， 熊新贵等 [22] 对13例肝阳上亢的高血压病患者， 运用 （2-DE+PMF+DBR）技术对患者血清蛋白质组进行 了分析， 并与10例健康组血清进行对照， 利用凝胶电 泳技术共检测出500个蛋白点， 与健康组比较， 有16 个明显差异的蛋白点， 差异蛋白点胶内酶分解后经 PMF-DBR发现， 肝阳上亢患者血清中甲基-天冬氨 酸蛋白受体、 血清铜蓝蛋白、 转铁蛋白、 维生素结合 蛋白、 载脂蛋白等表达均上调， 糖蛋白表达下调。 同 时， 周凌燕等 [23] 用甲状腺素钠和附子汤灌胃复制甲亢 肝阳上亢证动物模型， 取出大鼠下丘脑后加入组织 裂解液后进行组织分解， 高速离心后取其上清液进 行2-DE， 相同条件下识别的蛋白质点个数分别为正 常组 （764±30）个、 模型组 （755±28）个。 通过对比分 析， 模型组中蛋白质点表达上调的点有18个， 下调的 点有24个。
2.2 同病异证 在血瘀证的研究中， 王刚等 [24] 采 用荧光差异蛋白电泳 （2D-DIGE）结合质谱蛋白组学 技术， 发现冠心病患者心血瘀阻证和心肾阴虚证相 比共有10种差异表达蛋白， 而且差异蛋白主要涉及 补体和凝血级联通路及阿尔兹海默信号通路。 赵慧 辉等 [25] 选取了8例心绞痛血瘀证患者， 运用2-DE技术 进行蛋白组学研究， 胶图分析共检测出16个差异点， 差异点胶内酶解后发现， 载脂蛋白J、 载脂蛋白A-I在 血瘀证减轻后表达增加， 纤维蛋白质原β链， 维生素 D结合蛋白、 结合珠蛋白β链、 白蛋白亚型在血瘀证 程度变轻后表达降低。 吴红金等 [26] 对冠心病血瘀证 患者的血浆蛋白质组学研究中发现， 正常人和血瘀 证血清蛋白样品， 去除白蛋白后进行凝胶双向电泳 得到正常人蛋白点个数为（256±11） ， 血瘀证蛋白点 个数为 （273±12） ， 然后对差异蛋白点进行凝胶酶切 提取， 发现， 冠心病血瘀证患者血浆与正常人相比， 升高的蛋白质有免疫球蛋白、 纤维蛋白原、 粒酶， 冠 心病心血瘀阻证患者血浆与正常人相比， 降低的蛋白 质有CD44SP。
此外临床实验研究还涉及到肿瘤 [27-29] 、 结核 [30] 、 肾病 [31] 、 抑郁症 [32] 等相关疾病。 同病异证有不同的本 质内涵（有多个不同的蛋白表达） ， 异病同证有共同 的物质基础（有共同的蛋白表达） [33] ， 相信随着蛋白 质组学技术的进一步发展， 将对中医证候的实质性 研究有进一步的推动作用。
问题与展望
目前， 蛋白质组学的研究途径有二条： 一是像基 因组学一样， 力图穷尽人类基因数据库中的所有蛋白 质， 建立蛋白质组学数据库； 二是着重寻找和筛选有 意义的因素引起的两个样本之间的差异蛋白质谱获 得对某些关键蛋白的定性和功能分析。 这种寻找特 殊标志蛋白与关键蛋白的研究称之为差异蛋白质组 学。 差异蛋白质组学和证候一样具有动态性， 反映 蛋白质的动态本质。 而且差异蛋白质组学在技术上 具有更好的可实现性 [34] 。 笔者认为， 差异蛋白质组学 在中医证候实质的研究中， 以及对未来精准医疗体 系的建立， 必将起到越来越重要的作用。 据此笔者提 出了有关差异蛋白质组学的具体研究途径： 分别从 健康人群、 同病异证、 异病同证和同一患者不同证候 阶段作为每个疾病的切入点， 分别从中提取样本作 为研究对象。 对每种疾病进行差异蛋白质组学分析， 从而鉴定出差异蛋白点。 最后获得每种疾病证候的 生物学实质与证型的生物标记物， 从而使证候研究 走向规范化与标准化。
来源：中华中医药杂志 作者：宋明 陈家旭 刘玥芸 李晓娟 侯雅静 王方方 邱文琪 吴芊