骨质疏松症属于中医“骨痿” 范畴。中医理论 认为， 肾藏精主骨生髓， 精足则髓足， 骨骼得养则强 健有力; 精亏则髓减， 骨失其养则脆弱易折， 就会发 生 “骨痿” ， 即骨质疏松症。本研究拟采用动物实 验， 从现代医学角度探讨中医“髓减致痿” 理论的科 学性， 并为中医 “肾主骨” 理论提供实验依据。
1 材料与方法
1. 1 材料
1. 1. 1 实验动物 SPF 级雌性 SD 大鼠 60 只， 体质量( 210 ±10) g， 由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供 ( 许可证号 SCXK- ( 军) 2007- 004) ， 饲养于中国中医科学院中医基础理论研 究所实验动物室( 实验动物使用许可证号 SYXK ( 京) 2010- 0032) 。 1. 1. 2 药物 左归丸药液组成: 熟地 24 g， 山 药 12 g， 山萸肉 12 g， 莬丝子12 g， 枸杞子12 g， 川牛 膝 9 g， 龟板胶 12 g， 鹿角胶 12 g。常规水煎减压浓 缩， 制备成浓度为 0. 968 g 生药/ml 的药液。戊酸 雌二醇: 拜耳医药保健有限公司广州分公司产品 ( 批号234A， 1 mg/片) 。临用时， 将戊酸雌二醇碾碎 后， 用纯净水制成浓度为 0. 0092 mg/ml 的混悬液。
1. 1. 3 主要试剂和仪器 主要试剂: 甲基丙烯 酸甲 酯 为 天 津 市 福 晨 化 学 试 剂 厂 产 品 ( 批 号 20130407) ; 甲基丙烯酸丁酯为国药集团化学试剂有 限公司产品( 批号 20120411) ; 苯甲酸甲酯为天津市 光复精细化工研究所产品( 批号 20100115) ; 聚乙二 醇 400 为国药集团化学试剂有限公司产品( 批号 20120714) ; 过氧化苯甲酰为国药集团化学试剂有限 公司产品( 批号 T20090409) ; N， N- 二甲基对甲苯胺 为 ALDＲICH 公司产品( 批号 04327MB- 235) 。 主 要 仪 器: Skyscan1174 Micro- CT ( 比 利 时， Bruker 公司) ; Ｒeicheit- Jung2040 切片机( 德国， Leica 公司) ; DM 6000B 正置显微镜( 德国， Leica 公司) ; Qwin Pro V3. 5. 0 图像分析系统( 德国， Leica 公司) 。
1. 2 方法
1. 2. 1 动物分组及处理 将 60 只 SD 雌性大 鼠以体质量按随机数字表法分为空白对照组12 只， 假手术组 12 只， 造模组 36 只。造模组大鼠按照文 献 ［1 ］ 方法切除大鼠双侧卵巢， 假手术组仅摘除卵巢 附近的部分脂肪组织但不摘除卵巢。术后 10 d， 再 将造模组 36 只大鼠以体质量按随机数字表法分为 模型组、 阳性对照组及补肾组各 12 只。然后开始灌 胃给药， 补肾组灌胃给予 0. 968 g 生药/ml 的左归丸 药液， 给药体积为 1 ml/100 g 体质量， 给药剂量为 9. 68 g 生药/kg 体质量; 阳性对照组给予 0. 0092 mg/ml 的戊酸雌二醇混悬液， 给药体积为1 ml/100 g 体质量， 给药剂量为 0. 092 mg/kg。每天灌胃 1 次， 连续 6 d， 休息 1 d 再给药 6 d， 如此连续给药 3 个 月。每周称重 1 次， 据此调整给药量。空白对照组、 假手术组和模型组按上法给予等体积的纯净水。 末次 给 药 后，将 各 组 大 鼠 用 戊 巴 比 妥 钠 ( 45 mg/kg体质量) 腹腔注射麻醉， 然后迅速处死。 取右侧胫骨及股骨 4% 多聚甲醛固定， 分别用于不 脱钙骨切片制作和 Micro CT 检测。
1. 2. 2 指标检测方法 ( 1) Micro CT 检测。 采用 Micro- CT 对各组大鼠的股骨进行扫描。将大 鼠右侧股骨从固定液中取出后置于生理盐水中浸 泡， 为防止扫描过程中样本出现脱水和移位， 扫描时 将股骨用浸有生理盐水的湿纸巾包绕后放到样本管 中， 固定在 Micro CT 载物台上。电压 50 kV， 电流 800 μA， 以180°扫描角度、 12 μm 扫描分辨率、 1304 × 1024 视野大小沿股骨长轴方向对股骨远端进行扫 描。将生长板下 1mm 定为扫描参考线， 扫描参考线 以下 1. 5 mm 的区域设定为三维重建兴趣区域 ( range of interests ＲOI) ， 用 N- Ｒecon 软件进行骨小 梁三维图像重建， 用 CT- AN 软件进行三维分析， 获 得骨体积分数 BV/TV( %) ， 即所选区域内骨小梁总 体积与样本总体积之比; ( 2) 骨组织形态计量学指 标检测。取右侧胫骨近端 1/3 去除软组织， 乙醇逐 级脱水， 二甲苯透明， 塑料包埋。在 Ｒeicheit- Jung 2040 切片机上， 用钨钢刀分别切出 5 μm 的纵向不 脱钙骨切片， 甲苯胺蓝染色。 参照文献 ［2 ］ 所述方法， 采用 Qwin Pro V3. 5. 0 图像分析系统， 对不脱钙骨切片的以下指标进行计 量: ① 骨小梁体积百分比( TBV%) : 骨小梁体积占 被测骨髓腔总体积的百分比是衡量骨量水平的主要 标志; ②骨小梁吸收表面百分比( TＲS%) : 凹凸不 平、 不规则的骨小梁表面占骨小梁表面的百分比: ③骨小梁形成表面百分比( TFS%) : 有成骨细胞被 覆的类骨质表面占骨小梁表面的百分比。骨丢失率 ( %) = ( 每只大鼠的 TBV% 值 － 空白对照组大鼠 TBV%平均值) /空白对照组大鼠 TBV% 平均值 × 100%。骨丢失率为正值时表示骨量增加， 绝对值越 大表示骨量增加越多; 为负值时， 表示骨量丢失， 绝 对值越大表示骨量丢失越多 ［3 ］ 。骨髓腔内脂肪细 胞体积百分比( ABS%) : 骨髓腔内脂肪细胞的面积 占被测骨髓腔面积的百分比。
1. 3 统计学方法
采用 SPSS 20. 0 统计软件进行统计分析， 实验 结果以均数 ± 标准差( 珋 x ± s) 表示， 正态分布采用单 因素方差分析， 非正态分布数据采用 Kruskal- Wallis 1- way ANOVA( k samples) 检验。
2 结果
2. 1 各组大鼠股骨 BV/TV 的变化
表 1 图 1 比较， 与假手术组比较， 模型组、 补肾 组和阳性对照组大鼠股骨的 BV/TV 显著减少; 与模 型组比较， 补肾组和阳性对照组大鼠股骨的 BV/TV 值显著增加。
表 1 各组大鼠股骨 BV/TV 变化比较［例( %) ］
组 别 例数 BV/TV
空 白 对 照 组 12 17. 15 ±2. 06
假 手 术 组 12 16. 54 ±2. 27
模 型 组 12 8. 12 ±1. 69 ＊＊
阳 性 对 照 组 12 12. 31 ±2. 05 * ##
补 肾 组 12 11. 01 ±2. 33 ＊＊#
注: 与假手术组比较: * P ＜0. 05， ＊＊ P ＜0. 01; 与模型组比较: # P ＜ 0. 05， ## P ＜0. 01
2. 2 各组大鼠胫骨 TBV%及骨丢失率的变化
表 2 显示， 模型组、 补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的 TBV%显著低于假手术组; 而补肾组和阳性对 照组的 TBV%显著高于模型组。与假手术组比较， 模型组、 补肾组和阳性对照组大鼠胫骨的骨丢失率 ( 绝对值) 显著增加; 而与模型组比较， 补肾组和阳 性对照组的骨丢失率( 绝对值) 显著减少。
表 2 各组大鼠胫骨 TBV%及骨丢失率的变化
组 别 例数 TBV% 骨丢失率( %)
空 白 对 照 组 12 31. 63 ±3. 61 —
假 手 术 组 12 30. 64 ±4. 25 －3. 42 ± 6. 46
模 型 组 12 16. 43 ±3. 29 ＊ ＊ －48. 05 ±10. 41 ＊＊
阳 性 对 照 组 12 24. 12 ±2. 94 ＊ ＊ ## －23. 79 ± 9. 30 ＊＊##
补 肾 组 12 21. 31 ±3. 09 * ## －32. 65 ± 9. 77 ＊＊##
注: 与假手术组比较: * P ＜0. 05， ＊＊ P ＜0. 01; 与模型组比较: # P ＜ 0. 05， ## P ＜0. 01
2. 3 各组大鼠胫骨 TＲS%、 TFS% 及 TＲS/TFS 的变化
模型组、 补肾组和阳性对照组与假手术组比较， 大鼠胫骨 TＲS%、 TFS%和 TＲS/TFS 均显著增加; 而 与模型组比较， 补肾组和阳性对照组的 3 个指标均 显著减少。
表 3 各组大鼠胫骨 TＲS%、 TFS%及 TＲS/TFS 的变化
组 别 例数 TＲS% TFS% TＲS/TFS
空白对照组 12 2. 38 ±0. 55 4. 78 ±0. 68 0. 51 ±0. 14
假 手 术 组 12 2. 32 ±0. 74 4. 52 ±0. 53 0. 52 ±0. 17 模 型 组 12 9. 29 ±2. 39 ＊＊ 7. 76 ±0. 72 ＊＊ 1. 22 ±0. 39 ＊＊
阳性对照组 12 4. 04 ±1. 33 ＊＊## 5. 61 ±0. 94 * ## 0. 74 ±0. 27 * ## 补 肾 组 12 5. 04 ±1. 06 ＊＊## 6. 39 ±0. 75 ＊＊## 0. 80 ±0. 19 ＊＊##
注:与假手术组比较: * P ＜ 0. 05， ＊＊ P ＜ 0. 01; 与模型组比较: # P ＜ 0. 05， ## P ＜0. 01
2. 4 各组大鼠骨髓腔中脂肪细胞变化
2. 4. 1 光镜下观察 图 2 显示， 模型组大鼠胫 骨骨小梁较空白对照组和假手术组显著减少， 其排 列稀疏， 间距加宽， 小梁之间连接差。髓腔中的脂肪 细胞呈圆形或类圆形的空泡状， 模型组中的脂肪细 胞较空白对照组和假手术组显著增多， 而其他骨髓 细胞相对减少。补肾组和阳性对照组的骨小梁较模 型组明显增多， 而脂肪细胞明显减少， 其他骨髓细胞 相对增多。
2. 4. 2 各组大鼠胫骨骨髓腔中 ABS%的变化 表 4 显示， 与假手术组比较， 模型组、 阳性对照 图 2 各组大鼠胫骨骨髓腔中脂肪细胞分布情况 注: a: 空白对照组; b: 假手术组; c: 模型组; d: 阳性对照组 e: 补肾组; 箭头所指的白色部分是骨髓腔中的脂肪细胞 组和补肾组大鼠胫骨骨髓腔中 ABS% 显著增加; 与 模型组比较， 补肾组和阳性对照组 ABS%显著减少。
表 4 各组大鼠胫骨骨髓腔内 ABS%的变化
组 别 例数 ABS%
空 白 对 照 组 12 3. 73 ±1. 01
假 手 术 组 12 3. 52 ±0. 83
模 型 组 12 16. 63 ±2. 93 ＊＊
阳 性 对 照 组 12 10. 15 ±2. 24 ＊＊##
补 肾 组 12 9. 46 ±2. 47 ＊＊##
注: 与假手术组比较: * P ＜0. 05， ＊＊ P ＜0. 01; 与模型组比较: # P ＜ 0. 05， ## P ＜0. 01
与空白对照组比较， 假手术组的上述指标均未 发生明显改变， 从而排除了手术因素对实验的影响。
3 讨论
骨质疏松症属于中医“骨痿” 范畴 ［4 ］ 。“骨痿” 之名首见于《黄帝内经》 。《素问·痿论》 云 : “肾气 热， 则腰脊不举， 骨枯而髓减， 发为骨痿” ; “肾者水 脏也， 今水不胜火， 则骨枯而髓虚， 故足不任身， 发为 骨痿。 ” 明确指出 “髓减 ” “髓虚” 是导致“骨痿” 的重 要原因。中医理论认为， 肾藏精主骨生髓。如《素 问 · 六节脏象论》 : “肾者， 主蛰， 封藏之本， 精之处 也……其充在骨 ” ; 《素问 · 阴阳应象大论》 : “肾生骨 髓 ” ; 《素问 · 痿论 》 : “肾主身之骨髓” ， 都将肾- 精- 髓- 骨的生理功能紧密结合在一起。正如《中西汇通医 经精义》 所言 : “肾藏精， 精生髓， 髓生骨， 故骨者肾 之合也。髓者， 肾精所生， 精足则髓足， 髓在骨内， 髓 足则骨强。 ” 由此可见， 肾实精足则骨髓生化有源， 骨髓充足骨得以充分滋养而坚固有力; 若肾虚精少、 骨髓化生乏源、 骨髓减少、 骨乏其养就会导致骨 痿 ［5 ］ 。综上所述 ， “髓减” 是“骨痿” 发生的基本病 机， 所以历代医家治疗骨质疏松症多从补肾入手， 将 “补肾益精生髓” 作为治疗该病的基本大法。 本研究结果显示， 大鼠切除卵巢后骨丢失显著 增加， BV/TV 以及 TBV% 显著减少; 而代表骨吸收 指标的 TＲS% 和 TＲS/TFS 以及代表骨形成指标的 TFS%均显著增高， 说明卵巢切除所造成的是一种 骨吸收和骨形成均增高， 但由于骨吸收大于骨形成， 进而导致骨量丢失的高转换型骨质疏松症。病理观察显示， 模型组大鼠胫骨骨小梁较假手术组显著减 少， 其排列稀疏、 间距加宽发生“骨痿” 。同时， 髓腔 中的脂肪细胞较假手术组显著增多， 而其他骨髓细 胞相对减少。形态计量结果进一步显示， 模型组 TBV%显著减少的同时， 其 ABS% 显著增高。脂肪 细胞的显著增多， 导致其他骨髓细胞明显减少， 即出 现了 “髓减” 。这一结果说明 ， “髓减” 与“骨痿” 之 间存在着密切联系。而采用左归丸补肾后， 在骨小 梁明显增多的同时， 髓腔中 ABS%明显下降， 即髓腔 中的脂肪细胞明显减少， 而骨髓细胞明显增多， 从而 进一步证明中医 “髓减致痿” 病机的正确性， 同时也 说明 “肾主骨” 理论的科学性。
现代研究表明， 大鼠脂肪基质干细胞( adipose tissue - derived mesenchymal stem cells，ADSCs) 具有 多向分化潜能， 在体外经诱导剂诱导后显示出较强 的成骨分化能力。雌二醇可促进 ADSCs 的增殖， 并 能提高其向成骨细胞分化的能力 ［6- 8 ］ 。本实验结果 显示， 去卵巢大鼠补充雌二醇后骨髓中的脂肪细胞 明显减少， 而其他骨髓细胞明显增多， 从而说明雌激 素在诱导脂肪基质干细胞向其他骨髓细胞的转化过 程中起重要作用， 给予去卵巢大鼠左归丸后也产生 了同样的结果。据此推测， 补肾可能有促进脂肪基 质干细胞向成骨细胞分化的能力， 进而使脂肪细胞 明显减少， 而使其他骨髓细胞相应增加， 即通过“增 髓” 而达到治疗“骨痿” 的作用， 对此还有待进一步 的深入研究。
参考文献:
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